Clonación de secuencias de alfavirus y flavivirus para su uso como controles positivos en el diagnóstico molecular / Cloning alphavirus and flavivirus sequences for use as positive controls in molecular diagnostics

RESUMEN El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

ABSTRACT The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

Analysis of real time PCR amplification efficiencies from three genomic region of dengue virus / Análisis de las eficiencias de amplificación por PCR en tiempo real de tres regiones genómicas del virus dengue

Early diagnosis of dengue virus (DENV) infection represents a key factor in preventing clinical complications attributed to the disease. The aim of this study was to evaluate the amplification efficiencies of an in-house quantitative real time-PCR (qPCR) assay of DENV, using the non-structural conserved genomic region protein-5 (NS5) versus two genomic regions usually employed for virus detection, the capsid/pre-membrane region (C-prM) and the 3’-noncoding region (3’NC). One-hundred sixty seven acute phase serum samples from febrile patients were used for validation purposes. Results showed that the three genomic regions had similar amplification profiles and correlation coefficients (0.987-0.999). When isolated viruses were used, the NS5 region had the highest qPCR efficiencies for the four serotypes (98-100%). Amplification from acute serum samples showed that 41.1% (67/167) were positive for the universal assay by at least two of the selected genomic regions. The agreement rates between NS5/C-prM and NS5/3’NC regions were 56.7% and 97%, respectively. Amplification concordance values between C-prM/NS5 and NS5/3’NC regions showed a weak (k= 0.109; CI 95%) and a moderate (k= 0.489; CI 95%) efficiencies in amplification, respectively. Serotyping assay using a singleplex NS5-TaqMan® format was much more sensitive than the C-prM/SYBR Green® I protocol (76%). External evaluation showed a high sensitivity (100%), specificity (78%) and high agreement between the assays. According to the results, the NS5 genomic region provides the best genomic region for optimal detection and typification of DENV in clinical samples.

El diagnóstico precoz de la infección por el virus dengue (DENV) constituye un elemento clave para la prevención de las complicaciones clínicas propias de la enfermedad. El objetivo del estudio fue evaluar la detección de DENV mediante un ensayo cuantitativo de PCR-tiempo real (qPCR), desarrollado localmente, utilizando la región no-estructural-5 (NS5), versus dos regiones tradicionalmente empleadas para la detección del virus, la región cápside/pre-membrana (C-prM), y la región noncodificante-3’ (3’NC). Se recolectaron 167 muestras de suero de pacientes en fase aguda de la enfermedad. Las tres regiones génicas tuvieron perfiles de amplificación/coeficientes de correlación similares (0,987-0,999). Sin embargo, la región NS5 tuvo la eficiencia de amplificación más elevada para los cuatro serotipos (98-100%). Durante el proceso de validación, 41,1% (67/167) de las muestras de suero resultaron positivas para DENV al menos por dos de las regiones genómicas empleadas. Los valores de concordancia entre las regiones NS5/C-prM y NS5/3’NC fueron de 56,7% y 97%, respectivamente. La concordancia fue débil entre las regiones NS5/C-prM (k= 0,109; CI 95%), sin embargo, fue moderada entre las regiones NS5/3’NC (k= 0,489; CI 95%). El ensayo de tipificación uniplex en formato NS5/TaqMan® mostró alta sensibilidad (100%) que el protocolo C-prM/SYBRGreen®-I (76%). La validación externa del ensayo mostró una alta sensibilidad (100%), especificidad (78%) y acuerdo alto entre los ensayos utilizados. De acuerdo a los resultados obtenidos, la región NS5 ofrece la mayor opción para la detección y serotipificación del DENV en muestras clínicas.

Epidemiología molecular de los virus Dengue / Molecular epidemiology of Dengue virus

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos a humanos por su alta morbimortalidad y el potencial de diseminación de su vector Aedes aegypti. Además, la falta de una vacuna y medicamentos antivirales específicos, así como el incremento progresivo de las infecciones secundarias y la hiperendemicidad en diferentes países, hacen de esta enfermedad un problema de salud pública. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV), dentro de cada serotipo se han descrito varios genotipos, constituidos a su vez por diferentes linajes o clados. La epidemiología molecular combina los análisis filogenéticos de los DENV detectados en un área geográfica, en un tiempo definido, con la información clínica y epidemiológica disponible. El objetivo de estos estudios es tratar de establecer asociaciones entre genotipos o linajes virales con el origen (ancestros), procedencia geográfica, ruta de transmisión viral, severidad de la enfermedad, grupos poblacionales afectados, y la intensidad y extensión de los brotes epidémicos. La epidemiología molecular ha generado información relevante como la etiología del DENV genotipo Asiático en los casos graves de dengue de la epidemia ocurrida en Venezuela en 1989, y la identificación de cambios nucleotídicos puntuales en el genoma viral asociados a propiedades biológicas fundamentales. En la actualidad se hace necesario realizar análisis exhaustivos del genoma viral completo, conjuntamente con el análisis bioinformático, biológico, clínico y epidemiológico de los cuatro serotipos circulantes en los países endémicos, así como instaurar en los laboratorios adscritos a los sistemas de vigilancia epidemiológica del dengue, la vigilancia molecular para la identificación de genotipos (o linajes) circulantes, lo que contribuiría entre otros aspectos al control efectivo de la enfermedad por DENV.

Dengue is the most important viral disease transmitted by mosquitoes to humans in tropical and subtropical regions of the world. This is the result of its high morbidity and mortality, the spread potential of the vector Aedes aegypti, the lack of effective vaccines and specific antiviral drugs, the gradual increase in secondary infections and hyperendemicity differences in distinct countries. There are four serotypes of dengue virus which are phylogenetically grouped in genotypes and subdivided in lineages or clades. Molecular epidemiology combines phylogenetic analysis of DENV detected in particular geographic areas within a defined time with the available clinical and epidemiologic information. The objective of these studies is to look for relationships between genotypes or lineages, viral origin, geographical spreading and routes of viral transmission, disease severity, population groups affected, and the intensity, speed and extent of outbreaks. Also, molecular epidemiology has generated relevant information such as the Asian genotype DENV etiology in cases of the severe dengue epidemic in Venezuela in 1989, and the identification of specific nucleotide changes in the viral genome associated with its fundamental biological properties. However, analysis of the complete viral genome, together with bioinformatic, biological, clinical and epidemiological analysis corresponding to the four serotypes circulating in endemic countries should be performed. Molecular surveillance for the identification of genotypes (or strains) circulating should be implemented in the laboratories responsible for the epidemiological surveillance of dengue, which would improve the effective control of DENV.

Influencia de las variables climáticas en la casuística de dengue y la abundancia de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) en Maracay, Venezuela / Influence of climatic variables on dengue cases and abundance of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Maracay, Venezuela

Se realizó un estudio retrospectivo y longitudinal en el área metropolitana de Maracay para el período 1997-2005, a fin de determinar si las variables climáticas y entomológicas influyen sobre la casuística de dengue. Se obtuvieron los datos climatológicos diarios y mensuales de la Estación Climatológica de la Universidad Central de Venezuela y los datos epidemiológicos basados en casos confirmados y muy sugestivos reportados por el Laboratorio Regional de Diagnóstico e Investigación del Dengue y otras Enfermedades Virales (LARDIDEV). Los datos entomológicos se obtuvieron de colectas de adultos de Aedes aegypti (L.) realizadas durante el período Noviembre 2000-Diciembre 2001. La abundancia del vector varió de 3,6 Aedes/casa durante el mes de Abril (período de sequía) a 14,7 Aedes/casa durante el mes de Agosto (período de lluvia). El análisis de correlación de Pearson mostró correlación positiva entre el número de casos reportados con la precipitación (r= 0,7183, P = 0,0038) y la abundancia de Ae. aegypti (r= 0,677, P = 0,0078), pero no con la temperatura ni la humedad relativa para el período Noviembre 2000-Diciembre 2001. El análisis de regresión mostró que para dos meses de rezago existe una regresión lineal altamente significativa (P < 0,0001) con un ajuste de R2= 88,7%, indicando que en promedio, la mayor casuística de dengue ocurre dos meses después de ocurrido el pico de precipitación. Los resultados obtenidos podrían ser utilizados para diseñar e implementar programas para la vigilancia epidemiológica y entomológica del dengue, así como establecer un sistema de alerta temprana para la prevención de brotes y/o epidemias de la enfermedad.

In order to determine the influence of climatic and entomological variables on the number of dengue cases, a retrospective and longitudinal study was conducted in the metropolitan area of Maracay during the period 1997-2005. Daily and monthly climatological data was obtained from the Climatological Station at the Universidad Central de Venezuela and epidemiological data based on confirmed and highly suggestive cases reported by the Regional Laboratory for Diagnosis and Research on Dengue and other Viral Infections (LARDIDEV). Aedes aegypti (L.) adults were collected monthly between November 2000 and December 2001. Vector abundance varied from 3,6 Aedes/house during April (dry season) to 14,7 Aedes/house (rainy season). Pearson correlation analysis showed a positive correlation between the number of dengue cases and rainfall (r= 0,7182, P =0,0038) and abundance of Ae. aegypti (r= 0,667, P =0,0078), but no correlation was found with temperature or relative humidity. Regression analysis showed that there was a highly significant relation (R2 = 88,7%, P< 0,0001) between rainfall and dengue cases at a lag of 2 months. The present results might be used to design and implement programs for the epidemiological and entomological dengue surveillance as well as to establish an early warning system to prevent epidemics.

Incidencia de infecciones sintomáticas y asintomáticas por virus dengue en Maracay, Venezuela: 2006-2007 / Incidence of symptomatic and asymptomatic dengue virus infections in Maracay, Venezuela: 2006-2007

Con el objetivo de estimar las tasas de incidencia de infecciones sintomáticas y asintomáticas por virus dengue (DENV) durante un año (octubre 2006-septiembre 2007) en cuatro barrios de Maracay (Venezuela) se realizó un estudio prospectivo consistente de visitas domiciliarias, tres veces por semana, para detectar casos de dengue y de encuestas serológicas semestrales para determinar infecciones asintomáticas probables por DENV. Los sujetos de estudio pertenecían a una cohorte de 2663 personas ≥5 años de edad. El diagnóstico confirmatorio de DENV se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Las pruebas serológicas se realizaron mediante el ensayo inmunoenzimático de captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA). Los resultados determinaron tasas de incidencia de 5,7 y 18,6 por 100 000 personas/día (p/d) para las infecciones sintomáticas y asintomáticas, respectivamente. La tasa de incidencia de las infecciones sintomáticas observada en las personas <15 años de edad fue significativamente mayor que la encontrada en los sujetos ≥15 años (15,8 versus 2,9 por 100 000 p/d). Por otro lado, las tasas de incidencia de las infecciones asintomáticas en ambos grupos de edad fueron similares (17,3 y 18,9 por 100 000 p/d, respectivamente). Se detectaron los cuatro serotipos del DENV en tres de los barrios estudiados. Se observó que la edad y la hiperendemicidad fueron probablemente los factores que más contribuyeron a la incidencia del dengue en los cuatro barrios investigados. Seguramente, las infecciones asintomáticas contribuyeron a incrementar la transmisión viral en el área de estudio.

The incidence rates of symptomatic and asymptomatic dengue virus (DENV) infections in four "barrios" of Maracay, Venezuela, during one-year (October 2006-September 2007) were estimated. A prospective study consisting of house visits three-times a week to detect dengue cases, and semiannual serological surveys to determine probable asymptomatic dengue virus (DENV) infections was conducted. The study subjects belonged to a cohort of 2,663 people ≥5 year-old. Confirmatory diagnosis of DENV infections was carried out by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Serological surveys were performed by anti-dengue IgM-capture immunoassay (MAC-ELISA). The results showed that the incidence rates for symptomatic and asymptomatic infections were determined to be 5.7 and 18.6 per 100,000 persons/day (p/d), respectively. The incidence rate of symptomatic infections was significantly higher in persons <15 year-old than that found in subjects ≥15 years (15.8 versus 2.9 per 100,000 p/d). On the other hand, the incidence rates of asymptomatic infections in both age groups were similar (17.3 and 18.9 per 100,000 p/d, respectively). All four DENV serotypes were detected in three of the four "barrios" studied. Finally, age and hyperendemicity were probably the contributing factors to the incidence of dengue in the four "barrios" investigated. Surely, the asymptomatic infections contributed to increase the viral transmission in the study area.

Diagnóstico de laboratorio de infecciones por el virus dengue en el estado Aragua Venezuela: octubre 1997-diciembre 1998 / Laboratory diagnosis of dengue virus infections in Aragua state Venezuela: october 1997-december 1998

La eficacia de un sistema de vigilancia epidemiológica proactivo para predecir epidemias de dengue de la capacidad del laboratorio para detectar tempranamente la circulación viral. Este estudio muestra los resultados de la vigilancia virológica del dengue, realizada en el estado Aragua (Venezuela) desde octubre 1997 hasta diciembre 1998. Se evluaron 547 sueros de pacientes sospechosos de dengue mediante las técnicas de aislamiento viral y serotipicación por inmunofluorescencia (AVSI), reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), inmunoensayo enzimático de captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA) e inhibición de la hemaglutinación (IHA). De los sueros examinados, 97,4 por ciento resultaron positivos a por lo menos una técnica; de estos, 60,4 por ciento fueron clasificados como casos confirmados (virológicamente positivos) y 39,6 por ciento como casos probables (virológicamente negativos, serológicamente positivos). Aunque la gran mayoría de los casos positivos ocurrieron en los períodos epidémicos de 1997 y 1998, el incremento paulatino de las tasas de serotipos entre ambos períodos sugería la llegada de la epidemia de 1998. Se detectaron pacientes infectados con virus Den-1 (51,2 por ciento), Den-2 (37,9 por ciento), Den-4 (10,6 por ciento), y una infección mixta por Den-2 y Den-4 (0,3 por ciento). Se confirma la hiperdemicidad del dengue (co-circulación de Den-1, Den-2 y Den-4) en el estado Aragua, conjuntamente con la detección de pocos pasos (6,5 por ciento) de fiebre hemorrágica de dengue/síndrome de choque por dengue (FHD/SCD); 38,1 por ciento de estos casos ocurrieron en pacientes con infecciones secundarias. El alto porcentaje (85,7 por ciento) de casos de FHD/SCD infectados con el virus Den-2 apoya la reportada virulencia de este serotipo

Comportamiento biológico de 3 cepas del virus dengue-2 en 2 líneas celulares de mosquitos / Biological behavior of 3 strains of the dengue-2 virus in 2 cell lines of mosquitoes

Strains A-15 (isolated in Cuba, 1981), Jamaica (isolated in Jamaica, 1981) and Nueva Guinea "C" (standard) from dengue-2 virus were compared according to the time of appearance of the cytopathic effect (CPE), to the time of appearance of specific fluorescence and to the kynetics of viral multiplication on being innoculated in the cell lines AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) and C6/36 HT (Aedes albopictus). The results showed that the CPE of highest intensity and earliest appearance was for A-15, followed by Jamaica and Nueva Guinea "C" (NGC). AP-61 seems to favor the CPE of Jamaica with respect to that of the same strain in C6/36 HT. The fluorescence was earlier for Jamaica and A-15 and more intensive for the latter, whereas NGC manifested late. This behaviour was similar in the 2 cellular systems. The greatest titres during the kinetics of viral multiplication were obtained from A-15 in both lines, although in AP-61 they tend to be equal from the 4th day on. The strain A-15 showed a particular behaviour of these biological properties on comparing them with the other strains under study, which may be related to changes found in its neucleotide sequence.

Estudio de algunas propiedades biológicas de 3 cepas de dengue 2 con diferencias en sus secuencias nucleotídicas / Study of various biological properties of 3 strains of dengue 2 with differences in their nucleotide sequences

Some biological properties of Dengue-2 strains such as A-15 (isolated in Cuba in 1981); Jamaica (isolated in Jamaica in 1981) and New Guinea "C" (NG"C") standard strain differing in their nucleotide sequences were studied. The results showed that the cytopathic effect in C6/36 HT cell line occurred earlier in A-15 strain and that fluorescence was first detected in Jamaica and A-15 strains. This seems to indicate that rapid detection of strains does not have any relation to neither their history of passage nor the original isolation system. A-15 and NG"C" strains exhibited an heterogeneous pattern formed by big and small plaques but average size of plaques in NG"C" was lower whereas Jamaica showed only small plaques. The most neurovirulent strain in mice was NG"G" followed by A-15 whereas Jamaica was not neurovirulent at all. These results indicate that A-15 has a different biological behaviour which is probably due to intrinsic differences. It should be taken into account that 7 amino acid changes were found in the envelope protein which may have affected the expression of some biological properties.

Dengue en Magdaleno, Estado Aragua: estudio seroepidemiológico en preescolares y escolares / Dengue in Magdaleno, State Aragua: seroepidemiologyc in the preschools and schools

El dengue se ha convertido en una importante enfermedad emergente en América debido a un aumento notable de la ocurrencia de casos de dengue hemorrágico y síndrome de choque por dengue. Venezuela desde 1989 ha sufrido epidemias severas, siendo el Edo. Aragua uno de los más afectados. El presente trabajo se realizó en el poblado de Magdaleno, ubicado al suroeste de Maracay y aledaño al Lago de Valencia, el cual cuenta con una población de 15.500 habitantes. Para el estudio fueron tomadas muestras de sueros de 652 niños, que asisten a dos escuelas de la localidad, con edades entre 4 y 14 años. Para la determinación de anticuerpos al virus dengue se utilizó la técnica de inhibición de la hemaglutinación. De los 652 sueros estudiados 486 (74,6 por ciento) presentaron anticuerpos entre 1:20 y 1:20 480, estando espuesta la mayoría de la población a infectarse o reinfectarse con el virus, con una alta probabilidad de presentar dengue hemorrágico y síndrome de choque por dengue. Además se estableció la presencia de anticuerpos tipo IgM al virus en 23 de los sueros (3,5 por ciento) utilizando para ello la técnica ELISA de captura, señalando de esta forma que dichos individuos sufrieron la infección por el virus en los últimos 3 meses. Estos hallazgos muestran una alta actividad del dengue en la zona lo cual ha de alertar a las autoridades de salud para implementar medidas para el control del vector así como subrayar la importancia de mantener la educación de la comunidad

El ensayo inmunoenzimatico en microgotas sobre nitrocelulosa (Dot-ELISA) en el diagnostico de la enfermedad de Chagas. II. Estudio seroepidemiologico en cuatro comunidades rurales de Venezuela / The Dot immunoenzymatic assay on nitrocellulose (Dot-ELISA) in the diagnosis of Chagas disease. II. Seroepidemiologic study in 4 rural communities of Venezuela

Se realizó estudio seroepidemiológico sobre la infección por Trypanosoma cruzi en habitantes de cuatro comunidades rurales de Venezuela, que presentan diferentes situaciones epidemiológicas en relación a la Enfermedad de Chagas, con la finalidad de evaluar la técnica de Dot-ELISA y compararla con las pruebas serológicas convencionales. En los caseríos de Kamana y caño Hondo del estado Zulia, donde no existe transmisión, la seropositividad fue 15,7% en adultos solamente. En las comunidades de las Rosas y Solano del estado Cojedes, área de alta endemicidad, la seropositividad en los menores de 14 años fue 8,9% y en los mayores de 15,51,6%. En el estudio comparativo con las pruebas serolgicas convencionlaes, Dot-ELISA presentó altos índices de co-positividad, co-negatividad y eficiencia. El valor predictivo positivo de la prueba fue de 66% y 60% con al antígeno citoplasmático e integral respectivamente, en el estado Zulia y 100% y 95% en el estado Cojedes. Estos resultados sugieren que Dot-ELISA puede ser una alternativa práctica para estudios seroepidemiológicos sobre la infección por Trypanosoma cruzi en los paises en desarrollo